Laboratorio. Crecimiento de levaduras y bacterias en diferentes medios de cultivo.

FUNDAMENTO TEÓRICO.

En laboratorio es muy frecuente recurrir a la propagación, multiplicación o crecimiento de microorganismos con el objeto de ser estudiados y examinados en sus procesos biológicos.

Para ello se usan distintos medios de cultivo, que pueden ser líquidos (caldo de cultivo), semisólidos o sólidos, según requiera el organismo a propagar.
El soporte utilizado para el cultivo será una placa de Petri, en caso de tener un medio sólido, o un tubo de ensayo o bote para medios líquidos.En esta ocasión vamos a hacer crecer en un medio sólido gelatinoso a base de agar agar un velo de flor común de la crianza biológica de vinos.

Se llama velo de flor al conjunto de levaduras autóctonas (se conocen más de doscientas) que son usadas para la crianza de vinos generosos, estas levaduras consumen glicerina, reducen bastante la acidez volátil del vino, el ácido málico y producen grandes cantidades de paraldehidos y acetaldehídos responsables de los aromas punzantes y almendrados característicos de estos vinos. La transformación que ejercen sobre el vino base es notable.

El aspecto del velo de flor es el de una más o menos densa capa de levaduras, de grosor variable y de color entre blanco y grisáceo, del grupo Saccharomyces, donde destacan beticus, montuliensis, cheresiensis y rouxii.

El objetivo de esta práctica es familiarizarnos con el cultivo de levaduras y observar su desarrollo.

Se utilizará la placa de Petri como soporte del cultivo. Fue ideada y construida en 1877 por el bacteriólogo alemán Julius Richard Petri cuando trabajaba como ayudante de Robert Koch, el premio Nobel descubridor del bacilo de la tuberculosis. Inventó el popular y sencillo doble disco de cristal que a partir de entonces facilitó enormemente la creación y aislamiento de microcosmos artificiales en el que poder observar procesos microbianos.

El medio será de agar agar, una gelatina vegetal de origen marino, procedente de la pared celular de varias especies de algas. Su nombre viene del malayo y significa jalea.

Usada desde antiguo en el este de Asia y llevada a Europa hacia la mitad del siglo XIX. Es un polímero de subunidades de galactosa, usado en cocina y en microbiología como gelificante y medio de cultivo.
El cultivo estará a una temperatura controlada en un autoclave, es un aparato habitual en los laboratorios de microbiología con sistema cerrado donde se forma vapor de agua que se somete a una presión elevada, una atmósfera, lo que hace que el agua alcance una temperatura de 121oC causando la desnaturalización de enzimas lo que conlleva a la muerte de los microorganismos y la destrucción de las esporas. Es decir, uno de sus usos es esterilizar a 121oC durante 20 minutos y 1 atmósfera de presión. El autoclave registra la evolución de los parámetros durante el tiempo que esté introducido el medio, dando un informe en papel con los datos obtenidos.

Materiales:

  • –  Placa de Petri
  • –  Botes autoclavables
  • –  Asa de siembra de tungsteno
  • –  Mechero de alcohol
  • –  Autoclave
  • –  Vaso de precipitados 500 mL
  • –  Cucharilla metálica
  • –  Peso electrónico
  • –  Papel secante
  • –  Cinta de pintor para etiquetas

    Medio de cultivo de levaduras:

  • –  Levaduras de velo de flor en vino tinto
  • –  Medio YPD (Yeast extract Peptona Dextrosa)

    – Extracto de levadura 1%. Cód. 403687 – Peptona 2%. Cód. 403695
    – Glucosa 2%. Cód. 4074
    – Agar agar 2%. Cód. Merk 105463

    – Agua destilada

 

PROCEDIMIENTO.

1. Preparación del medio YPD.
– De cada bote de nutrientes de levadura se toma la cantidad adecuada según el porcentaje indicado, pesándolos en peso electrónico y depositándolos sobre un trozo de papel. Las cantidades en gramos son las siguientes:

  • –  Extracto de levadura – 5 g
  • –  Peptona – 10 g
  • –  Glucosa – 10 g
  • –  Agar–10g

    – El resto del contenido del medio se rellena con agua destilada hasta llegar a 500 mL. – Se introduce todo en un bote autoclavable y se mezcla bien para conseguir una solución homogénea, el tapón se coloca pero no se enrosca del todo para que no estallen los botes cuando estén en el autoclave.

    – Se anota en la etiqueta la fecha y contenido del bote.
    – Se procede a autoclavar, se introducen los botes que quepan dentro, y se programa a temperatura de 121oC, 1 atmósfera y 20 minutos. Se autoclavó el 24/02/2015.
    (A tener en cuenta que 1 atm es igual a 1.013249966 bares, que es unidad de presión). – Una vez terminado el procedimiento, se deja reposar.
    – El 03/03/2015 se calientan las muestras autoclavadas al baño maría para que se desolidifiquen y se deposita el líquido en las placas de Petri, esperamos a que vuelvan a gelificar y seguidamente se prescintan con parafilm y se reservan.

     

    (Tener en cuenta que debe haber una fuente de calor con llama junto a las placas de Petri en el momento de depositar el medio líquido en ellas para que no se contaminen por microbios presentes en el aire).

    2. Siembra de levaduras de velo de flor.
    – El 03/03/2015, se realiza una siembra por zonas con objeto de aislar las futuras colinias de levaduras y observar cómo prosperar.
    – Se toma el asa de siembra y se calienta al rojo con el mechero de alcohol.
    – A continuación apoyándose sobre una mesa con una mano se abre parcialmente la tapa de la placa de Petri, en un ángulo de 45 grados aproximadamente, con la otra mano sujetando el asa de siembra se captura una pequeña porción de levadura de velo de flor de vino tinto del bote que la contiene y con sumo cuidado se pinta con ella sobre la superficie del medio de agar sin llegar a penetrar en la gelatina.

Se procede de este modo:

  1. Se pinta en zigzag sobre un tercio de la gelatina, se vuelve a poner al rojo el asa

    de siembra, se pone en contacto con la gelatina para que pierda calor y no mate

    a la levadura.

  2. Se toma una pequeña porción de levadura esta vez de la propia siembra sobre el

    medio, haciendo un segundo zigzag sobre otro tercio de la placa, con un trazo más separado, y se vuelve a poner al rojo el asa de siembra, se pone en contacto con la gelatina para que pierda calor.

  3. Se toma una última y minúscula porción del último zigzag y se repite el procedimiento, de manera que cada vez hay menos concentración de levadura por superficie del medio de agar.
  4. Se tapa la placa de Petri y se marca la fecha y nombre de la siembra.

    Croquis de siembra

    captura-de-pantalla-2017-01-29-a-las-21-38-06

RESULTADOS.

El 13/03/2015 se aprecia bastante bien la evolución de las colonias de levaduras, nos encontramos con colonias aisladas de levadura de velo de flor en el último tercio de la siembra y en el segundo tercio, y colonias aglomeradas de levaduras en el primer tercio de la siembra, el de mayor densidad de población.

Se puede decir que la práctica ha sido un éxito, por su resultado positivo del crecimiento de levaduras, y además podemos observar otras colonias que también han prosperado en este medio:

Moho. Hongos invasores que forman filamentos unicelulares o pluricelulares, los hay de muchos tipos, crecen con facilidad en medios cálidos y húmedos.
En este caso formar algunas colonias de gran tamaño sobre todo en el primer tercio de la siembra, donde la humedad y la concentración de levaduras ha sido mayor.

Respecto a la levadura espontánea que ha prosperado en el medio tengo mis dudas sobre cuál es de las dos que defino a continuación:

  1. Candida lusitaniae. Levadura considerada patógeno nosocomial, está constituida por células gemantes de forma elipsoidal. No forma hifas ni, en consecuencia, presenta tubo germinal, aunque es frecuente observar la formación de pseudomicelio. En los medios de cultivo habituales, las colonias son de color rosado y aspecto cremoso, deslizantes, blandas y suaves.
  2. Rhodotorula rubra. Levadura unicelular Basidiomycota con un característico pigmento rojizo, del cual viene su nombre, puede crear rudimentarios micelios, es poco frecuente asociarla a infecciones micóticas en seres humanos.

A continuación vemos la doble gráfica de los datos tomados en el autoclave.

captura-de-pantalla-2017-01-29-a-las-21-41-24

El total de tiempo que estuvieron los medios fue de 43 minutos.

BIBLIOGRAFÍA.

http://www.unavarra.es/genmic/micind-2-1.htm

es.slideshare.net/cesarturo26/practica-1-crecimiento-levaduras

Aislamiento de Rhodotorula sp. en un paciente críticamente enfermo. Descripción de un caso y revisión de la literatura. Nancy Cure Ruiz.

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