Laboratorio. Tinción simple y tinción diferencial de bacterias

Primera parte: Tinción simple de bacterias Acetobacter aceti.

Materiales:

  • –  Vinagre
  • –  Vidrio-reloj
  • –  Mechero de alcohol
  • –  Portaobjetos y cubreobjetos
  • –  Micropipeta
  • –  Microscopio óptico
  • –  Tinte cristal violeta
  • –  Aceite de inmersión
  • –  agua destilada en bote limpiador
  • –  Papel secante.

    El objetivo de esta práctica común es observar forma, tamaño y agrupación del organismo de las bacterias acetobácter. La fermentación alcohólica da lugar al etanol, y con la oxidación del etanol se produce ácido acético, donde viven estas bacterias acéticas, imprescindibles en la obtención de los vinagres.

    Procedimiento:

    – Se coloca una gota de agua destilada en un portaobjetos limpio.
    – Se toman 250 microlitros (0,25 ml) de vinagre con la micropipeta y se extiende sobre la gota de agua destilada.
    – Se fija cuidadosamente por calor con el mechero de alcohol.
    – Se tiñe con cristal violeta, esperamos unos cinco minutos.
    – Se lava con agua destilada para eliminar el exceso de colorante.
    – Se tapa el preparado con el cubreobjetos.
    – Se coloca en el microscopio.

Las células de bacterias son difíciles de ver al microscopio por su poco contraste con el medio en el que se encuentran, así que con colorantes resultará mucho más fácil observarlas. En este caso sólo es necesario un colorante.

Células bacterianas acéticas en formación de racimo: Aumento x100 al microscopio.

El objetivo de aumento x100 se usa con aceite de cedro, conocido como aceite de inmersión, esto es porque la distancia focal de un objetivo tan potente es muy pequeña, y entra muy poca luz, entonces se unta una gota de aceite, de indice de refracción casi

igual al vidrio, los rayos de luz continúan su camino sin desviación, consiguiendo así que una mayor cantidad de luz llegue al objetivo y sea posible observar por él.

Explicamos lo que se observa:

Agrupaciones en racimo de células ovoides y redondas, muy parecidas a racimos de uvas, con diferente cantidad de células por agrupación, distinta forma de racimos, algunas aparecen sueltas por parejas o tríada. La pared celular es gruesa. En el grupo de la derecha, en la imagen anterior, parece haber una zona de transformación o de división celular de célula madre.

Captura de pantalla 2018-01-31 a las 19.46.08

Células bacterianas acéticas en formación de racimo. Aumento x100

Segunda parte: Tinción diferencial. Bacterias lácticas Oenococcus oeni.

El objetivo de la práctica es observar forma, tamaño y agrupación de las bacterias lácticas del yogurt como Oenococcus oeni y aprender a utilizar el método de tinción diferencial.
Uno muy usado en microbiología es la tinción de Gram. Basándose en su reacción a esta tinción, las bacterías pueden dividirse en dos grupos: grampositivas y gramnegativas: La distinta reacción nos indica diferencias fundamentales de la pared celular de las distintas bacterias.

Las gramnegativas son constantes en su reacción, tienen una capa interna delgada cubierta por capas externas de densidad menor, lipopolisacáridos, lipoproteínas, proteínas, glicopéptido.
las grampositivas pueden presentar respuestas variables en ciertas condiciones, tienen una capa densa y uniforme, ácidos teicoicos, polisacáridos, proteínas, mayor porcentaje de glicopéptido.

Algunas grampositivas pierden propiedad de retener el cristal violeta, y en consecuencia, se tiñen por la safranina apareciendo como gramnegativas.
Las bacterias gram+ se verán al microscopio color violeta y las gram- de color rosado o rojizo claro.

Materiales:

  • –  Yogurt comercial
  • –  Mechero de alcohol
  • –  Portaobjetos y cubreobjetos
  • – Vidrio-reloj
  • –  Micropipeta
  • –  Microscopio óptico
  • –  Cristal violeta (primera tinción)
  • –  Lugol (solución iodada, mordiente)
  • –  safranina (colorante de contraste)
  • –  Etanol
  • –  Aceite de inmersión
  • –  agua destilada en bote limpiador
  • –  Bastoncillo

– Papel secante.

En un portaobjetos limpio se extiende con un bastoncillo un poco de yogur.
Fijar la extensión cuidadosamente por el calor de la llama del mechero hasta que se seque.
Añadir dos o tres gotas de etanol sobre la muestra para eliminar las grasas, esperar cinco minutos y lavar con agua destilada.
Coloración:
– 2 minutos en cristal violeta
– Se lava con agua destilada
– 1 minuto en lugol
– Se decolora con metanol, dejar actuar 30 segundos
– Se lava con agua destilada
– 1 minuto en safranina
– Se lava
– Se seca suavemente con papel de filtro
– Una vez que la preparación esté seca, poner una gota de aceite de inmersión y observar al microscopio con el objetivo x100.

Bacterias lácticas con doble tinción a aumento x100.

¿Qué forma tienen las bacterias observadas?

Tienen forma ovoide, algunas un poco arriñonadas, de menor tamaño que muchas células, las vegetales por ejemplo que comparadas al microscopio con un aumento x100 se veían claramente mucho mayores.

¿Están aisladas o agrupadas? ¿Qué tipo de agrupación?

Se presentan sobre todo agrupadas, en formación de cadenas retorcidas y enredadas de cocos o bacilos. También hay un pequeño porcentaje que aparecen aisladas.

¿Qué tipo de Gram son?

Las bacterias lácticas pertenecen a la clasificación de gram positivas, como podemos apreciar en la imagen tomada del microscopio, donde vemos a estas bacterias teñidas de color añil violetáceo. Es cierto que más que tonos violetas presentan tonos azulados, pero en cualquier caso si al violeta le falta rojo aparece azulado. Si fueran gram negativas presentarían una tinción rojiza,y justo ese color no lo encontramos.

Captura de pantalla 2018-01-31 a las 19.54.41

Bacterias lácticas con tinción doble o diferencial, a aumento x100.

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